一、實驗目的： 
　　1、了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理； 2、掌握測定細菌生理生化反應的技術和方法。 
　　二、實驗原理： 
　　各種微生物在代謝類型上表現了很大的差異。由于細菌特有的單細胞原核生物的特性，這種差異就表現的更加明顯。不同細菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質的能力不同，所以其發酵的類型和產物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統。即使在分子生物學技術和手段不斷發展的今天，細菌的生理生化反應在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。 
　　三、實驗條件： 
　　菌種  
　　大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種  
　　培養基  
　　葡萄糖蛋白胨水培養基、蛋白胨水培養基、糖發酵培養基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）。  
　　試劑  
　　40％NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示劑。  
　　器具 
　　超凈工作臺、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。 
　　四、實驗步驟： 
　　(一)    糖類發酵試驗  
　　1、目的：了解不同細菌分解利用糖的能力及實驗原理，并掌握其操作方法。
　　2、原理：可根據細菌分解利用糖能力的差異表現出是否產酸產氣作為鑒定菌種的依據。是否產酸，可在糖發酵培養基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經培養后根據指示劑的顏色變化來判斷。是否產氣，可在發酵培養基中放入倒置杜氏小管觀察。 
　　3、材料：菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）的斜面菌種  培養基：葡萄糖、蔗糖和乳糖發酵培養液試管  
　　4、流程：  
　　發酵液試管→標記→接種→培養→觀察→記錄  
　　5、步驟：                        
　　5.1 試管標記：取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發酵培養液試管各4支，每種糖發酵試管中均分別標記大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形菌和空白對照。
　　5.2  接種培養：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，每種糖發酵培養液的空白對照均不接菌。將裝有培養液的杜氏小管倒置放入試管中，置37℃恒溫箱中培養，分別在培養24h、48h、和72h觀察結果。  
　　5.3  觀察記錄：與對照管比較，若接種培養液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“＋”表示。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產酸并產氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“－”表示。  
　　（二） 乙酰甲基甲醇試驗(V．P試驗)  
　　1、目的：了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操作方法。 
　　2、原理：某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養液中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V．P（+）反應。 
　　3、材料：  
　　3.1 菌種： 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌
　?。‥nterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種  
　　3.2 培養基： 葡萄糖蛋白胨培養液的試管  
　　4、流程  
　　培養液試管→標記→接種→培養→觀察→記錄   
　　5、步驟  
　　5.1  標記試管：取5支裝有葡萄糖蛋白胨培養液的試管，分別標記大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。